Après le lycée, elle a d'abord étudié au Huntingdon College, à Montgomery (Alabama), puis à l'université de l'Alabama, à Tuscaloosa, où elle a participé au journal de l'établissement, dont elle est devenue rédactrice en chef.
En 1956, ses amis Michael Martin Brown, un compositeur, et sa femme Joy lui firent don d'une importante somme d'argent, afin qu'elle puisse se dédier à l'écriture pendant toute une année. Le couple l'aida également à trouver un agent, grâce à qui elle publia son premier livre, Ne tirez pas sur l'oiseau moqueur.
Elle a accédé à la célébrité avec ce best-seller, devenu un classique de la littérature américaine, vendu à plus de 30 millions d'exemplaires dans le monde et adapté au cinéma en 1962 avec Gregory Peck. Ce titre est resté pendant très longtemps le seul ouvrage qu'elle ait jamais publié. Un des plus proches amis d'enfance d'Harper Lee était l'écrivain Truman Capote, qu'elle a assisté au début de sa carrière, le soutenant notamment au cours de l'écriture du roman De sang froid (Gallimard, 1966).
La romancière est revenue dans l'actualité en 2015, avec la publication de son second titre, Va et poste une sentinelle, cinquante-cinq ans après son premier opus. Ce titre, dont le manuscrit a été retrouvé par Harper Lee elle-même dans ses archives, est paru le 3 juillet chez HarpeCollins aux Etats-Unis. Cette "suite" de Ne tirez pas sur l'oiseau moqueur a été le livre le plus vendu outre-Atlantique l'année dernière.